1背景介紹
哮喘又名支氣管哮喘，是一種由復雜細胞組分及因子共同參與的常見多發性疾病。哮喘的特征是氣道的慢性變應性炎癥，其主要特征是氣道發炎，呼吸系統阻力增加等，在其發病因素中最重要的外因是變應原，塵螨是引起哮喘發病的主要變應原之一，因此復制塵螨模型在哮喘的研究中非常重要。目前國內多采用屋塵螨提取液，其成分較為復雜，很難復制出天然的塵螨致過敏性哮喘模型，因此本研究采用ALK公司的屋塵螨變應原制劑對動物進行多次腹腔注射致敏以及霧化激發進行造模，該屋塵螨變應原制劑是大分子量蛋白的混合物，吸附在氫氧化鋁上，從而達到緩慢釋放，長久刺激動物的呼吸系統。本研究以幼齡SD大鼠為研究對象，建立屋塵螨誘發的幼齡大鼠哮喘模型，對模型的肺功能和病理改變等主要指標進行檢測，并采用硫酸特布他林片考察模型的適用性，為哮喘治療藥物開發提供合適的模型工具。
2 材料和方法
2.1實驗動物
48只SPF級SD大鼠，3周齡，雌雄各半，體質量50~80 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。
2.2主要試劑和儀器
（1）主要試劑：屋塵螨變應原制劑；IgE、His ELISA試劑盒。
（2）主要儀器：超聲霧化器；酶標分析儀；振蕩式肺功能檢測系統；生物顯微鏡。
2.3試驗方法
（1）分組：將幼齡大鼠按照體質量和性別隨機分為陰性對照組、模型對照組、陽性對照組（予硫酸特布他林片），每組8只動物，雌雄各半。
（2）造模：陰性對照組以PBS溶液致敏和激發，其余各組大鼠均于分組后腹腔注射屋塵螨變應原制劑（1000 SQ-U/mL,0.1 mL/只），每天注射1次，連續3 d，末次致敏后間隔14 d進行激發，激發方法：動物置于霧化裝置中，每天不間斷霧化吸入屋塵螨變應原制劑（2000 SQ-U/mL)5 min，連續霧化激發7 d。
（3）給藥：按體表面積等效劑量法折算，設定陽性對照組（硫酸特布他林片）的給藥劑量為0.72 mg/kg，前4 d給予等體積的純水，后3d給予硫酸特布他林藥液。
（4）檢測指標：①各組大鼠均于末次激發后，采用1.5%戊巴比妥鈉注射液尾靜脈注射麻醉，然后行頸部正中氣管切開并插管，測定
呼吸系統阻力（Rrs）、呼吸系統順應性（Crs）及呼吸系統彈性（Ers）。②測定結束后采用腹主動脈采血法將動物安樂死，取全血測定
白細胞總數。③剩余血液不抗凝，分離血清，用于
IgE、His表達水平的測定。④剖取動物肺臟稱取質量計算
肺臟系數。⑤將各組動物肺臟組織用10%甲醛固定，經脫水、石蠟包埋，切片，常規HE染色后，光鏡下觀察各組動物的
肺臟組織病理學變化。
3試驗結果
3.1 肺功能
與陰性對照組相比，模型對照組動物Rrs、Ers均顯著升高，Crs顯著降低；與模型對照組相比，陽性對照組動物Rrs、Ers均顯著降低，Crs顯著升高。見表1。
表1 大鼠肺功能指標檢測結果
|
組別 |
n |
Rrs(cmH2O·s/mL) |
Crs (mL/cmH2O) |
Ers (cmH2O/mL) |
|
陰性對照組 |
8 |
0.1126±0.0020 |
0.7715±0.0269 |
1.3790±0.0506 |
|
模型對照組 |
8 |
0.1363±0.00524△ |
0.5554±0.03094△△△ |
1.7912±0.0778 △△△ |
|
陽性對照組 |
8 |
0.1104±0.0022 ∗ |
0.6927±0.0221 ∗ |
1.5026±0.0325∗∗ |
注：與陰性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與模型對照組比較，∗P<0.05，∗∗P<0.01，下同。
3.2 肺臟系數
與陰性對照組相比，模型對照組動物肺臟系數顯著升高。與模型對照組相比，陽性對照組動物肺臟系數顯著降低，見表2。
表2 大鼠肺臟系數統計結果
|
組別 |
n |
體質量(g) |
肺臟質量（g) |
肺臟系數（%） |
|
陰性對照組 |
8 |
287.00±22.00 |
1.39±0.08 |
0.48±0.01 |
|
模型對照組 |
8 |
286.00±21.00 |
1.57±0.09 |
0.55±0.02△ |
|
陽性對照組 |
8 |
304.00±23.00 |
1.44±0.08 |
0.48±0.02∗ |
3.3 白細胞總數
與陰性對照組相比，模型對照組動物白細胞總數顯著增多。與模型對照組相比，陽性對照組動物白細胞總數未見明顯差異，見表3。
表3 大鼠血液中白細胞總數統計結果
|
組別 |
n |
白細胞總數 (×10^9/L) |
|
陰性對照組 |
8 |
2.80±0.34 |
|
模型對照組 |
8 |
6.22±0.5544 |
|
陽性對照組 |
8 |
5.15±0.79 |
3.4 血清lgE及His表達水平
與陰性對照組相比，模型對照組動物血清中IgE、His表達水平均顯著升高。與模型對照組相比，陽性對照組IgE、His表達水平均無顯著差異，見表4。
表4 大鼠血清中IgE及His表達水平
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組別 |
n |
IgE(μg/mL) |
His(ng/mL) |
|
陰性對照組 |
8 |
22.02±0.85 |
11.67±0.16 |
|
模型對照組 |
8 |
25.02±0.4944△△ |
12.54±0.2244△△ |
|
陽性對照組 |
8 |
23.93±0.68 |
12.12±0.22 |
3.5 各組大鼠肺組織病理學檢查結果
陰性對照組動物肺臟各級管腔結構正常，肺泡腔無擴張或縮小，間質支氣管/血管無疏松或狹窄，亦未見炎細胞浸潤，見圖1。模型對照組動物肺臟氣道壁皺縮、血管周圍疏松/水腫、支氣管/血管間質炎細胞（以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主）浸潤，而陽性對照組動物上述病變均有不同程度的減輕。
圖1 大鼠肺臟組織病理學變化（HE染色，100×）
4試驗結論與討論
本研究采用吸附于氫氧化鋁上的屋塵螨變應原制劑對4周齡大鼠進行腹腔注射致敏，間隔2周后進行霧化激發，該誘喘劑致敏、激發后在幼齡動物體內緩慢釋放，不斷刺激動物發育階段的呼吸系統，較好地模擬出臨床上兒童因長期處于粉塵環境中而導致的過敏性哮喘疾病。本試驗結合哮喘的發病機制，采用屋塵螨對動物進行致敏和激發造模。模型建立成功后主要從肺功能、免疫應答、炎癥、肺水腫、肺組織病理學等幾個方面考察硫酸特布他林片對幼齡動物哮喘的改善作用。首先采用振蕩式肺功能檢測系統測定大鼠的肺功能指標，結果顯示模型對照組動物呼吸系統阻力及彈性均顯著升高，順應性顯著降低，表明模型動物已具有明顯的呼吸功能障礙。病理學檢查發現模型對照組動物表現出明顯的氣道壁皺縮，血管周圍疏松/水腫。推斷上述病理變化為導致模型動物呼吸系統阻力及彈性升高、順應性下降的主觀因素，而硫酸特布他林片在0.72 mg/kg劑量下對動物呼吸系統阻力及彈性的降低均有不同程度的逆轉作用，進而導致動物的順應性升高。綜合病理學結果表明，硫酸特布他林片可以很好地緩解幼齡哮喘動物的氣道壁皺縮，血管周圍疏松/水腫，改善幼齡哮喘動物的呼吸功能。本研究采用陽性藥硫酸特布他林片評估所建立的哮喘動物模型的穩定性，可用于藥效學評價研究。
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